从《指导原则》中分析参考品盘设计

2019年12月05日国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布最新一版《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则(2019年第83号)》  （以下简称“指导原则”），该指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，性能评价主要思路是：提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。

参考品作为性能评价的主要原材料，可谓是非常重要，文中对此做了详细的要求，今天我们就参考品做一些讨论。

原文：
4. 参考品要求
内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究及评价指标等。申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、基因序列设置等信息进行验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。

具体要求如下：
4.1阳性参考品及阳性质控品：
4.1.1阳性参考品
理想状态下，阳性参考品应当包括对所申报产品每个基因型的质控样本。但考虑到基于NGS技术的可检测基因数量较多，申请人应结合产品预期用途、临床意义及基因类型等因素进行针对性和代表性的设计。
对于有明确肿瘤伴随诊断相关的基因，应考虑该类基因参考品设置的合理性和完整性，需包括伴随诊断相关的全部热点基因，建议采用临床样本或细胞系提取的核酸储备液作为原料。
对于具有显著临床意义或潜在临床意义的基因，应考虑代表性问题，明确具有临床诊断意义的基因类型及基因型中不同的变异类型。突变频率、变异类型的选取应具有代表性，包括不同外显子，不同基因变异突变等。

如检测编码区较大且存在非热点区域设计（如大于1M），建议在阳性参考品中考虑对检测整体区域的灵敏度验证（主要关注SNV等），如混合的永生化正常人白细胞DNA储存液等。
不同突变/变异的变异丰度及突变频率，浓度范围设置应具有代表性并提供这样设定的依据。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法进行确认，并明确接受标准。申请人在设计阳性参考品时可一并考虑检测限参考品的设置及确认方式，并提供相关的依据。
4.1.2阳性质控品
模拟病人样本的目标核酸序列，并用于质控整个检测过程，包括核酸提取（如适用）、文库构建、测序和数据分析。目前阳性质控检测和分析过程应与临床样本方式一致。
4.2阴性参考品及阴性质控品
阴性参考品及阴性质控品建议为正常临床样本的混合物或细胞系，应明确不含有目标区域肿瘤突变基因。
4.3精密度参考品
精密度参考品设置要求可参考阳性/阴性参考品。
4.4 PCR 试剂无模板质控品（No Template Control，NTC）（如适用）
申请人应根据申报产品特点设置NTC质控品及检测接受标准，监测检测过程中是否存在污染。

从原文中可以看出：
1.参考品是必须要的；
2.阳性参考品设置最为复杂，着重聚焦临床意义的基因位点，不要求全覆盖，同时要考虑灵敏度（最低检出限LoD）设置，考虑到浓度梯度或突变梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应检出要求；
3.阳性质控品应该匹配整个检测过程，检测和分析应该与临床样本一致，用于阳性、阴性的判断；
4.阴性参考品和阴性质控品可以为正常临床样本或者细胞系，可以两者用同一个；
5.精密度参考品主要用于使用相同的样本（包括检测临界值附近的样本）在各种特定条件下进行检测（如不同操作员，不同操作条件，不同检测天数，不同仪器等），并考虑检测中主要的变异来源，通过重复性检测来评价性能；
6.NTC主要是用于分析特异性，评估产品仅可检测到预期待测变异的能力。

综上所述，对于参考品的设计，我们可以得出如下的表格（本设计仅代表小编个人意见）
 

按照这个思路，我们一步一步来设计一个完整的panel。
首先第一步是选择基因位点，可以按照如下原则来设计：
1.如果是一个小panel，一般设计都是针对某一癌种，对应的基因都是比较明确，位点能明确的尽量明确，不能明确的尽量涉及多种类型，比如SNV、Insertion、Deletion、Fusion、CNV，更细分的话，还有frameshift_variant、inframe_deletion、inframe_insertion、missense_variant、Splice_acceptor_Variant、Splice_Donor_Variant、Synonmymous_Variant等等。
因此对应的参考品要求覆盖全基因，位点也尽量全覆盖，参考品信息可以在3044am永利集团官网查询www.cobioer.com，如果没有的位点，可以联系3044am永利集团定制位点。
 

2.如果是一个大panel，对于参考品、检测限、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆盖，并且固定的%AF和CN值的，因此按照《指导原则》的要求，我们应该选择具有临床意义的基因和位点来表征，首当其冲的就是NCCN指南提及的基因，另外再加一些临床药物研发的靶点和biomarker。其中需要特别注意的是由于NGS的探针原理，不能很好的分析出每一种fusion的断点信息（DNA层面，内含子断点不唯一），因此建议大Panel选择RNA作为fusion的检测对象，同样的也需要选择RNA作为参考品。

对于大panel的阳性质控品选择，可以选择泛肿瘤的质控品：
 

如下列举了常见的重要的基因位点信息，供大家参考，panel的参考品盘可以从中选取：
 

（部分截图）

完整表单请点击下载

有了选取的基因和位点，我们开始依次设计参考品、质控品、检测限和精密度，
1.阳性参考品盘

1.1根据目的选择全盘的基因和位点，比如按照癌种设计；
1.2尽量覆盖所有的基因和位点；
1.3尽量覆盖SNV、indel、fusion和CNV；
1.4尽量多种突变细分类型，尤其可以考虑一些内含子的剪切变异；
1.5Fusion可以选择DNA和RNA；
1.6多个位点要拆包设计，不能把临近甚至相同位点放在一个包里面；
1.7设计的每个包突变频率或者CN值固定，这样利于直接转变为检测限标准品；
1.8不同包之间，尽量互补；
1.9一定要关注内源突变的影响；
1.10如果能兼顾精密度、质控盘的设计是最好的，这样能一个包多种用途。
 

参考品盘设计好之后，就是实际落地去定制，这其中又涉及倍性、拷贝数的计算，还有最终检测的QC标准，一般是选择DdPCR定标，这些工作可以交给3044am永利集团，我们可以按照客户的要求定制符合标准的参考盘混合标准品。
 

同时3044am永利集团也推出了几款现货参考品盘，感兴趣的朋友可以点击表格查看：

 推荐阳性参考品盘：

2.检测限参考品
检测限参考品的设计比较简单，只要将前面定制的参考品盘稀释到待测的检测限即可，至于下降到什么标准，依据平台、待测样本等因素而定，一般灵敏度是早筛>液体活检>组织检测。
 

3.精密度参考品
精密度参考品一般是用于看体系的重复性，因此取决于实验室各项的变数多不多，对于单批次的参考品需要在不同条件下测试，同时不同批次的参考品也需要在不同条件下测试，尤其是LoD附近的检测重复性。
因此如果能做到完全把参考品的全部包都能充分验证精密度是最佳的，但是这样的话确实成本、周期都比较长，折中的选择是尽量选择全部的基因，位点可以是一部分，选择一个适中的突变频率或者CN值，再选择一个LoD附近的突变频率或者CN值（当然一般建立体系时还未知LoD的范围，因此这个可以后期测试），来做精密度的性能评价。
 

4.阳性质控品盘
阳性质控品盘应该匹配整个检测过程，检测和分析应该与临床样本一致，用于阳性、阴性的判断。
4.1可以选择细胞沉淀、石蜡块这样的样品形式，包含提取的过程；
4.2阳性质控品使用频率高，可以批量制备；
4.3阳性质控品用于阳性判断，因此只要包含所有的基因，不用所有的位点；
4.4阳性质控品用于阳性判断，出于容易检出的目的，可以设计高一些的突变频率和CN值。
 

3044am永利集团推出一款现货阳性质控品盘，包含基因多，突变种类齐全，可以点击表格查看。

  推荐阳性质控品盘：

针对大panel的阳性质控品，可以考虑泛肿瘤大panel参考品。

5.阴性参考品
阴性参考品建议为正常组织或者细胞系，只要明确不含有目标区域肿瘤突变基因即可。这里需要提醒的有四点：
5.1阴性参考品用量比较大；
5.2阴性参考品选择容易制备，而且稳定的样品，稳定是指稳定供应、基因组稳定；
5.3阴性参考品的突变验证尽量选择深度高的NGS或者DdPCR；
5.4阴性参考品还要测对应基因的CN值和倍性；

推荐阴性参考品：

 6.阴性质控品
参照5. 阴性参考品
推荐阴性质控品：

现在分子诊断技术日新月异，传统的PCR、Q-PCR、AMRS-PCR、FISH，一直都被大量用于临床诊断，到现在如日中天的NGS，越来越得到大家的认可，再到下一代的三代测序，读长长，周期短，便携，未来预期美好。技术的革新给患者带来新的希望，质量保障是希望的前提，参考品盘是质量检测有力的工具。

我们呼吁业内的每一家单位的每一个检测，都能用上参考品，对我们每一份发出的数据都能负责。